国家卫生和计划生育委员会办公厅


关于印发《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》等技术规范的通知

　　
卫办医政函〔2013〕402号



各省、自治区、直辖市卫生厅局（卫生计生委），新疆生产建设兵团卫生局：

　　根据人感染H7N9禽流感疫情联防联控工作机制会议议定事项及《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号，以下简称《通知》）精神，为指导医院做好人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作，我委组织制定了《医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序》（附件1），并委托中国疾控中心制定了《人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求》（附件2）等技术规范。现转发给你们（可从国家卫生和计划生育委员会网站医政管理栏目中下载），供医院在开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。

　　各省级卫生（卫生计生）行政部门要按照《通知》有关要求，组建省级疾控机构实验室和省级临床检验专家共同组成的专家组，对医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作提供技术指导和支持，负责医院实验室核酸检测质量控制工作。要组织本辖区人感染H7N9禽流感病毒核酸检测定点医院检验人员进行培训，认真学习掌握相关要求，提高检验人员技术能力和水平。医院开展病毒核酸检测时，应当按照技术规范有关要求，规范开展检测工作，重视实验室质量控制，保障实验室生物安全，做好检验人员职业防护，保证检测结果科学、可靠。



附件：1.医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序.docx

2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书.docx



国家卫生和计划生育委员会办公厅

2013年5月16日





医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序


　　　　 
　　　　一、目的
　　　　确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
　　　　二、适用范围
　　　　医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。
　　　　三、样本采集、运送和保存
　　　　尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
　　　　根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。样本的采集应当严格按照SOP进行。
　　　　样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。
　　　　样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
　　　　四、PCR检测
　　　　（一）样本处理
　　　　样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。
　　　　（二）试剂准备
　　　　试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。
　　　　（三）加样
　　　　加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
　　　　按试剂、仪器说明书完成加样和PCR反应管准备。
　　　　（四）PCR扩增检测
　　　　PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。
　　　　（五）结果分析
　　　　根据所用试剂盒说明书设置基线值（baseline）。荧光阈值（threshold）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且Ct值应大于所设置的扩增循环数（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。
　　　　（六）质量控制
　　　　检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本（多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。
　　　　试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试剂盒说明书进行。
　　　　（七）实验结果的判定与解释。
　　　　按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。
　　　　五、检测结果报告
　　　　按照试剂盒说明书进行。
　　　　六、其它注意事项
　　　　（一）人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、N95型口罩等）。样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。
　　　　（二）注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无DNA酶和RNA酶PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。
　　　　（三）实验应严格分区操作；各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台，以防污染。
　　　　（四）每批实验室后，可采取实验室通风、10%次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。
　　　　（五）使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考相应试剂盒说明书（见附件1、2）有关要求。
　　　　 
附件：1.H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
2.H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）说明书
 
　　　　【产品名称】
　　　　通用名称：H7N9亚型禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）
　　　　英文名称：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA（Fluorescence PCR）
　　　　【包装规格】48人份/盒。
　　　　【预期用途】
　　　　本试剂用于对咽拭子样本中H7N9亚型禽流感病毒RNA进行定性检测，用于H7N9禽流感病毒感染的辅助诊断及流行病学监控。
　　　　【检验原理】根据荧光PCR技术原理，针对H7N9亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行监控。
　　　　【主要组成成分】
　　　　 
　　　 
名称 成分 　　规格 数量(管)
H7反应液 　　含内标RNP 、H7亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
N9反应液 　　含内标RNP 、N9亚型特异基因的引物探针混合液 1.0ml/管 1
DNA聚合酶 　　DNA聚合酶，不可用其他同类DNA聚合酶替代 60μl /管 1
逆转录酶 　　逆转录酶，不可用其他同类逆转录酶替代 60μl /管 1
阳性对照 　　RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物 1.0ml/管 1
阴性对照 　　DEPC水 1.0ml/管 1
　　本品各组成成分均不得与其他产品或不同批号产品中的相应组成成分进行互换。
　　 
　　　　本品不包含，但对试验必须的设备和试剂：
　　　　生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、1.5 ml无核酸酶的离心管、全自动荧光PCR检测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒(硅胶膜吸附法，北京金豪制药股份有限公司，Cat：BJH101)。
　　　　【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，有效期2个月，阳性对照反复冻融次数不得超过5次。
　　　　【适用仪器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光PCR检测仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1. 样本类型：咽拭子。推荐使用金豪公司生产的微生物采样及运送管（12人份/盒）。
　　　　2. 拭子、采样管和保存液：
　　　　2.1拭子选择：应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。
　　　　2.2采样管：外螺旋口、耐-70℃冻存，可容纳3 ml病毒采样液。
　　　　2.3无菌病毒采样液：应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。
　　　　3.样本采集、运输和保存：
　　　　由于H7N9亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安全应按照“《人间传染的病原微生物名录》”中高致病性禽流感病毒进行管理。
　　　　3.1采集：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3ml保存液的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在48小时内送达实验室。
　　　　3.2保存和运输：新鲜采集样本应在4℃条件下48小时运送到检测实验室。保存样本可在-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。冷冻样本应在冷冻条件下送至实验室。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。
　　　　样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。临床样本保存在4℃不能超过4天。
　　　　4.咽拭子标本的处理
　　　　咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少 40 下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，用上清接种细胞或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
　　　　【检验方法】
　　　　1. 核酸提取：
　　　　取200μl咽拭子样本进行核酸提取。采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法)，该试剂盒可用于对呼吸道悬浮液样本中的病毒RNA提取，并按试剂盒说明书要求操作。
　　　　本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。
　　　　1.1. 准备及注意事项：
　　　　1.1.1 分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。
　　　　1.1.2  吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的eppendorf管中，于70℃预热。
　　　　1.1.3  冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。
　　　　1.1.4  区分操作中的离心设置（rpm和g），本产品操作过程均为室温离心。
　　　　1.1.5  助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。
　　　　1.2. 样本裂解及核酸吸附
　　　　1.2.1  在1.5ml无核酸酶的离心管中加入10μl助沉剂和400μl裂解液，加入200μl待处理样本，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400μl样本应分多次进行处理。
　　　　1.2.2  加入480μl无水乙醇，颠倒混匀，吸取600μl裂解混合物转移到核酸吸附柱中。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变乙醇用量。
　　　　1.2.3  3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体。
　　　　1.2.4  将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体。
　　　　1.3. 核酸纯化
　　　　1.3.1  将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中。
　　　　1.3.2  在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟。
　　　　1.3.3  倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。
　　　　1.3.4  重复一次1.3.2步骤(本步骤不用静置1分钟)。
　　　　1.3.5  将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。
　　　　1.4. 核酸洗脱
　　　　1.4.1  将核酸吸附柱装入一无核酸酶1.5ml离心管，小心在吸附膜中央加入50μl预热洗脱液，室温静置4分钟。
　　　　1.4.2  10000 rpm离心2分钟，离心管中液体即待测样本RNA。
　　　　2. PCR扩增：
　　　　2.1 实验设计：
　　　　2.1.1待检样本检测：每份样本分别使用2种反应液（H7和N9反应液）进行检测，综合2种反应液的检测结果对样本进行判定。
　　　　2.1.2对照品检测：每次试验都应设置阴性对照和阳性对照。
　　　　2.2反应体系的配制：
　　　　2.2.1准备工作：将2种反应液（H7和N9反应液）融化后振荡混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　2.2.2 2种反应体系（H7和N9）的配制：取2个1.5ml 无核酸酶离心管，计算待测样本数量(n)，分别取20μl×（n+2）反应液（H7和N9）、0.5μl×（n+2）DNA聚合酶和0.5μl×（n+2）逆转录酶充分混匀，离心6000rpm 10秒。
　　　　n + 2 = n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照；
　　　　2.3反应体系分管：
　　　　每份待测样本设置2个PCR扩增管（H7和N9），分别将每种反应体系按20μl/管分装至对应的PCR扩增管中。
　　　　2.4加样：
　　　　每份待测样本RNA、阳性对照、阴性对照以5μl/管分别加入2个PCR扩增管中。
　　　　2.5扩增检测：
　　　　将加样后的PCR扩增管分别转移到全自动荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，不同仪器的设置如下：
　　　　2.5.1全自动荧光定量PCR检测仪（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）扩增程序：
　　　　对于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光定量PCR检测仪，荧光信号设置为：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型号仪器可设置为FAM和HEX通道。荧光PCR扩增程序的设置见表1。反应总体积为25μl。
表1.荧光PCR扩增程序
　　步骤 　反应温度 　　时间 是否采集光 循环数
　　逆转录及变性 　50℃ 　30分钟 　　否 　　1
　95℃ 　3分钟 　　否
　　预扩增 　95℃ 　15秒 　　否 　　5
　50℃ 　30秒 　　否
　72℃ 　1分钟 　　否
　扩增及荧光收集 　95℃ 　10秒 　　否 　　40
　55℃ 　40秒 　　是
　　　　2.5.2 全自动荧光定量PCR仪（Roche LightCycler系列）扩增程序：
　　　　选择FAM、HEX通道收集荧光。荧光PCR扩增程序见表2。
表2.荧光PCR扩增程序
　　步骤 反应温度 　　时间 是否采集荧光 循环数
逆转录及变性 50℃ 　　30分钟 　　否 　　1
93℃ 　　3分钟 　　否
　　预扩增 93℃ 　　15秒 　　否 　　5
50℃ 　　30秒 　　否
72℃ 　　1分钟 　　否
扩增及荧光收集 93℃ 　　10秒 　　否 　　40
55℃ 　　40秒 　　是
　　 
　　　　3. 结果分析：
　　　　3.1本品H7荧光探针的报告荧光为FAM，N9荧光探针的报告荧光为FAM，RNP荧光探针的报告荧光为HEX。所以应选择FAM通道和HEX通道分析试验结果。
　　　　3.2 基线（Baseline）范围根据仪器要求设定，目的为校正背景荧光干扰，终止循环（End）一般设置为最强样本出现扩增信号的前3-4个循环。
　　　　3.3 阈值线用于判断样本是否扩增，应调整使阈值线高于荧光背景和阴性对照的荧光信号，或点击分析（Analysis）自动获得。
　　　　4. 质量控制：
　　　　每次试验应设置阳性对照和阴性对照，且应符合以下要求，否则试验结果不成立。
　　　　4.1阴性对照无Ct值或Ct值为0。
　　　　4.2 阳性对照Ct值小于30.0。
　　　　【参考值（参考范围）】
　　　　Ct值≤37.0报告该反应阳性；
　　　　无Ct值或Ct值为0报告该反应阴性；
　　　　37.0＜Ct值＜40.0为灰区；
　　　　内标RNP有效的范围为：0＜Ct值＜33.0；
　　　　【检验结果的解释】
　　　　1. 在内标RNP结果成立的条件下各种判读模式如下：
反应液 模式1 模式2 模式3 模式4
H7 - - + +
N9 - + - +
RNP + + + +
结果判断 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阴性 H7N9亚型禽流感病毒RNA阳性
　　注：在内标RNP结果不成立的条件下视为检测异常，应重新采样检测。
　　　　2. 结果在灰区的样本需重复试验：取200μl样本重新提取RNA（核酸分离试剂盒中裂解液、无水乙醇的用量加倍，其他组分的用量不变）并检测。复检结果Ct＜40.0的样本为阳性，否则为阴性。
　　　　3. 内标RNP检测靶物质为正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用于对样本中RNA的提取和扩增检测过程进行有效监控。
　　　　如果该份样本的RNP检测 Ct值≥33.0，可能为以下原因：
　　　　3.1 未采集到足够的正常人上皮细胞，应重新采样。
　　　　3.2核酸提取过程异常，导致RNA损失，应重新提取。
　　　　3.3样本中存在RT-PCR抑制物质，可稀释后检测；
　　　　【检验方法的局限性】
　　　　1.样本中RNA浓度低于本产品的最低检出值（100copies/ml）时可能出现假阴性。
　　　　2.目前研究显示，发病后两日内取样检测，病毒RNA检出率最高，随发病时间的延长，病毒被清除，病毒核酸的检出水平迅速下降。因此应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位取样检测。临床评价应结合其他临床症状和实验室检测指标进行判断。
　　　　【产品性能指标】
　　　　1.本品可最低检出100copies/ml稀释物。
　　　　2.本品对季节性流感（H1N1以及H3N2）灭活病毒、B型流感灭活病毒、高致病性禽流感灭活病毒（H5N1）RNA进行检测，结果为阴性。
　　　　【注意事项】
　　　　1.开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。
　　　　2.实验室配置和试验操作请按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》进行；整个检测过程应严格分区进行：PCR反应体系的配置区；标本处理、加样区；各区使用的仪器、设备、耗材和工作服应独立专用。
　　　　3.H7N9亚型禽流感为经呼吸道传播疾病，应按照相关要求进行。样本的采集、处理、运输和保存均存在一定生物危害。样本的采集、运输和保存应按照乙类传染病进行管理；标本的提取必须在生物安全二级实验室的负压生物安全柜中完成；试验中接触过标准品和对照品的废弃物品（如吸头）、扩增完毕的离心管、标本等应进行无害化处理后方可丢弃。
　　　　4.不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。
　　　　5. 本产品仅用于体外诊断检测。
　　　　【参考文献】
　　　　1. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS 233-2002）
　　　　2.《人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第2版）》
　　　　3.《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）
　　　　【生产企业】
　　　　企业名称：北京金豪制药股份有限公司
　　　　生产地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号
　　　　注册地址：北京市北京经济技术开发区运成街7号1号楼
　　　　邮政编码：100176
　　　　电话号码：010-67878866
　　　　传真号码：010-67881632
　　　　网    址：www.kinghawk828.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许20050017号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　

H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒
（PCR-荧光探针法）说明书
　　　　 
　　　　【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
　　　　英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)  
　　　　【包装规格】大包装，48反应/盒
　　　　【预期用途】
　　　　流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
　　　　本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
　　　　【检验原理】
　　　　本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
　　　　【主要组成成分】
组分名称 规格 数量
PCR检测试剂 AIV H7 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV N9 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV H7N9 PCR反应液B 288µl/管 1
AIV H7N9内标溶液 240µl/管 1
质控品 阴性质控品  200µl/管 1
AIV H7N9阳性质控品 200µl/管 1
 
　　　　【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
　　　　【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
　　　　2 样品采集、保存与运送。
　　　　标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
　　　　【检验方法】
　　　　1.核酸提取
　　　　建议取200µl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200µl样本中加入4µl内标溶液后进行核酸提取。
　　　　本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
　　　　2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）
　　　　2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系
　　　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5µl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
　　　　2.3探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。
　　　　3.结果分析
　　　　3.1 反应结束后保存检测数据文件。
　　　　3.2 分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
　　　　【质量控制】
　　　　阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
　　　　阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32；
　　　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
　　　　【结果判定】
　　　　1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值＞40，且在VIC检测通道均有对数增长期，可判样品为H7N9禽流感病毒阴性；
　　　　2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40；可判样品为H7N9禽流感病毒阳性；
　　　　3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果为H7及N9均阳性，则判H7N9禽流感病毒阳性；若重复检测结果仍为H7（或N9）阳性，则只能判禽流感病毒H7（或N9）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。
　　　　【检测方法的局限性】
　　　　1.样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关。
　　　　2.样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。
　　　　3.病毒在流行过程中的基因突变则也可能导致假阴性结果。
　　　　4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本处理时核酸提取效率存在一定差异，本试剂盒推荐使用本公司生产的核酸提取试剂盒（离心柱法），用户可根据具体要求进行选择确认。
　　　　5.本检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段.
　　　　【产品性能指标】
　　　　根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的分析灵敏度为1.0×103copies/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原体（甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1亚型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等）无交叉反应。
　　　　【注意事项】
　　　　1.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
　　　　2.为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
　　　　3.试剂使用前要完全解冻，8,000rpm离心数秒后使用；
　　　　4.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
　　　　5.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
　　　　6.本试剂盒内阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
　　　　【生产企业】企业名称：中山大学达安基因股份有限公司
　　　　生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路19号；广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号
　　　　邮   编：510665          
　　　　电   话：020-32290789、8008304008
　　　　传   真：020-32068820   
　　　　网   址：http://www.daangene.com
　　　　【医疗器械生产企业许可证编号】粤食药监械生产许20040999号
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
附件2

人感染H7N9禽流感病毒核酸检测实验室生物安全保障基本要求
 


　　　　为加强人感染H7N9禽流感病毒核酸检测规范化管理，做好实验室生物安全管理工作，根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院第424号令，以下简称《管理条例》）、《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部45号令，以下简称《管理规定》）等有关要求，制定本标准。供医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测时参考使用。
　　　　一、样本采集
　　　　（一）进行人感染H7N9禽流感病毒相关样本（以下简称“样本”）采集的操作人员必须经过生物安全培训合格，并具备相应的操作技能。
　　　　（二）样本采集过程中，操作人员要加强防护，应当穿戴防护服、眼罩、N95及以上水平的医用防护口罩、双层医用乳胶手套、帽子等个体防护装备。
　　　　（三）用于样本采集的主容器必须采用优质塑料材质，且大小适合、带螺旋盖、内有垫圈、无菌、耐冷冻的密闭容器。样本采集后，主容器盖必须盖严、拧紧，表面应当擦拭消毒。
　　　　（四）对诊疗过程中采集的各种临床样本，医疗机构应当加强生物安全管理，在进行动态风险沟通与评估基础上，采取样本登记造册、专库存放、专人负责以及必要的消毒处理等较严格的安全及安保管理措施。
　　　　（五）样本采集过程中产生的医疗废物要分类收集，应当在产生地点进行压力蒸汽灭菌或可靠的化学消毒，然后按感染性、损伤性等医疗废物收集处置。
　　　　二、样本包装和运输
　　　　（一）负责样本包装和运输的人员应当经过感染性物质包装、运输相关的生物安全培训，并取得相应资格。
　　　　（二）运输样本必须采取三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。
　　　　病毒培养物按照A类感染性物质进行包装运输，其他感染性物质按照B类感染性物质进行包装运输。
　　　　容器或包装材料应当达到国际民航组织《危险物品航空安全运输技术细则》相应包装标准，符合防水、防破损、防外泄、耐高温、耐高压的要求。
　　　　（三）样本包装过程中，操作人员要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款的相关要求采取加强防护。
　　　　（四）操作人员应当规范包装检测样本：
　　　　1.应当在实验室核心操作区内对装有样本的主容器外表面进行仔细检查并擦拭消毒，确保无泄漏、表面无残留物，并在外表面标明样本编号、种类、姓名及采样日期等信息。用足够的吸收材料包裹主容器，然后放入辅助容器，拧紧（A类）或封严（B类）辅助容器，必要时消毒辅助容器外表面。若多个主容器装入同一个辅助容器时，必须分别包裹，防止彼此接触，并在多个主容器外面衬以足够的吸收材料。
　　　　2.应在实验室清洁区采用适当的衬垫材料将辅助容器固定在贴有统一标识的外包装箱内，冰排或制冷器件应放在辅助容器和外包装之间。样本送检单、样本接收证明、准运证书、运送人员资质证明、发送和接收人员信息等相关文件材料应当放入防水的塑料袋中，置于外包装箱内上方。
　　　　（五）样本运输前应当联系接收机构实验室，告知样本送检目的、样本种类、数量和预计送达的时间等。
　　　　（六）负责运输样本的医疗卫生机构，应当按照《管理规定》有关要求，向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心申请办理《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本准运证书》。在每次运输结束后，运输单位须将运输情况向省级卫生行政主管部门或中国疾病预防控制中心书面报告。
　　　　（七）包装合格的样本（三层包装系统）可通过航空或陆路运输。陆路运输应专车运输，并由2名或以上经培训合格的人员护送。运输途中样本主容器应始终保持直立，运输车辆内应携带具备清单及有效物品的应急处置箱（包），其中包括个体防护装备、感染性材料溢洒处置器具、皮肤及创口处置器具、医疗废物收集器具以及“生物危险”、“禁止通过”等警示标识。有关单位或者个人不得通过公共电（汽）车和城市铁路运输相关样本。
　　　　三、样本接收和包装开启
　　　　（一）负责样本接收与包装开启的操作人员应具备相应的操作技能，通过生物安全培训并取得相应资质。
　　　　（二）样本包装的开启应在生物安全二级及以上级别的实验室进行。样本送检单、准运证书、人员上岗证等相关文件材料的核查、登记，以及相关风险沟通/评估和开具样本接收证明等工作应在实验室清洁区内进行。
　　　　（三）包装开启过程中，操作者要根据所处环境条件参照本标准第一条第二款相关要求适时加强防护。
　　　　（四）实验室操作人员应规范接收检测样本、开启包装：
　　　　1.操作人员应当在生物安全柜内开启三层包装系统的第二层辅助容器，并仔细检查主容器表面有否破损、泄漏或残留物，发现异常情况应当立即执行实验室应急处置程序，同时登记并报告实验室负责人。
　　　　2.操作者应当在生物安全柜内消毒主容器表面，核对样本信息，进行下一步的实验室检测活动，或转移至指定的保存/保藏地点及位置。
　　　　（五）包装开启和样本核查结束后，应当在实验室清洁区完成交接手续，开具样本接收证明，交还外包装和辅助容器等。实验室操作人员应对所有异常情况进行详细记录，运输和接受样本的双方人员签字确认。
　　　　四、样本分装和检测
　　　　（一）负责样本分装、检测的操作人员应当具备人感染H7N9禽流感病毒相应的实验操作能力，经过生物安全培训，并取得培训合格资质。
　　　　（二）实验室用于人感染H7N9禽流感病毒检测的设备、设施必须运行良好，生物安全柜和压力蒸汽灭菌器应当年检合格。
　　　　（三）在生物安全二级实验室从事相关实验活动时，操作人员应当配戴眼罩、N95及以上水平的医学防护口罩，穿戴防护服、双层乳胶手套等个体防护装备。
　　　　（四）实验室生物安全等级要求：
　　　　1.疑似病例未经培养的临床样本应当在生物安全二级实验室的生物安全柜内分装、灭活和核酸提取。
　　　　2.人感染H7N9禽流感病毒的分离培养应当在生物安全三级实验室进行。
　　　　3.动物感染实验应当在动物生物安全三级实验室进行。
　　　　（五）开展人感染H7N9禽流感病毒相关实验活动时，应当有２名以上的操作人员共同进行。
　　　　（六）实验过程中产生的医疗废物要分类收集，应在产生地点进行消毒灭菌，然后按医疗废物收集处置。
　　　　五、样本保存和销毁
　　　　（一）各医疗机构应当将阳性样本按照要求集中专库保存。
　　　　（二）阳性样本、分离物的保存及销毁应当按照《管理条例》等法规和规范性文件有关要求执行。

　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
　　　　 
河南省人大常委会


河南省实施《中华人民共和国森林法》办法

　

(2001年1月13日河南省第九届人民代表大会常务委员会第二十次会议通过　根据2005年1月14日河南省第十届人民代表大会常务委员会第十三次会议《关于修改〈河南省实施中华人民共和国森林法办法〉的决定》修正)

　　　
第一章　总　则

第一条　根据《中华人民共和国森林法》（以下简称《森林法》）、《中华人民共和国森林法实施条例》（以下简称《实施条例》）和有关法律、法规，结合本省实际情况，制定本办法。

第二条　省人民政府林业行政主管部门负责全省林业工作。

省辖市、县（市、区）人民政府林业行政主管部门负责本行政区域内的林业工作。

乡、镇人民政府负责本乡、镇林业工作。

第三条　各级人民政府应当把保护、发展森林资源纳入国民经济和社会发展计划，实行保护、发展森林资源任期目标责任制。森林资源的消长应当作为考核每届政府政绩的主要内容之一。

第四条　保护林农的合法权益，依法减轻林农的负担，禁止向林农违法收费、罚款，禁止向林农进行摊派和强制集资。

保护承包造林的集体和个人的合法权益，任何单位和个人不得侵犯承包造林的集体和个人依法享有的林木所有权和其他合法权益。

第二章　林权管理

第五条　森林、林木按照下列规定确定权属：

（一）国有林场、农场、苗圃、自然保护区、森林公园所属的森林、林木归国家所有。依法归公民、法人或者其他组织所有的森林、林木除外。

（二）机关、团体、部队、学校及其他企事业单位在其依法使用的土地上营造的林木，由营造单位管理并按照国家规定支配林木收益。

（三）农村集体经济组织营造的森林、林木，归该农村集体经济组织所有；合作营造的林木，归合作者共有或者依照合作合同的约定确定权属。

（四）农村居民在其宅基地、自留地、自留山和承包的责任田上种植的林木归个人所有。

（五）城镇居民和职工在自有房屋的庭院内种植的林木归个人所有。

（六）单位或者个人在依法通过承包、拍卖、租赁等形式取得使用权的国有或者集体所有的宜林荒山荒地上营造的林木，归营造者所有；合同另有约定的，按合同约定执行。该宜林荒山荒地上原有林木，由当事人在合同中约定权属和利益分配。

第六条　国家所有的和集体所有的森林、林木和林地，个人所有的林木和使用的林地，由县级以上人民政府登记造册，核发林权证书，确认所有权或者使用权。已经确权发证的，不得重复核发林权证书。

森林、林木和林地所有者和使用者的合法权益，受法律保护，任何单位和个人不得侵犯。

第七条　依法改变森林、林木和林地的所有权或者使用权的，所有权或者使用权的取得者应当到原发证机关办理权属变更登记手续，更换林权证书。

以用材林、经济林、薪炭林所有权作为抵押担保的，当事人应当到县级以上人民政府林业行政主管部门进行抵押登记，抵押登记办法由省人民政府林业行政主管部门制定并公布。

用材林、经济林、薪炭林的林地使用权以及国家规定允许转让的其他林地使用权也可以依法抵押，但不得擅自将林地改为非林地。当事人应当依法办理抵押登记。

第八条　单位之间发生的林木、林地所有权和使用权争议，在县（市、区）行政区域内的，由县（市、区）人民政府处理；个人之间、个人与单位之间发生的林木所有权或者林地使用权争议，由当地县级或者乡镇人民政府处理。跨县（市、区）的，由共同的上一级人民政府处理。

当事人对人民政府作出的确权决定不服的，可以在接到确权决定之日起一个月内向人民法院提起行政诉讼。经县级以上人民政府依法登记发证确认林木所有权或者林地所有权和使用权后，又发生民事侵权行为的，当事人可以直接向人民法院提起民事诉讼。

在林木、林地权属争议解决之前，任何一方不得砍伐有争议的林木，不得抢占有争议的林地。

第九条　1985年1月1日《森林法》实施以前发生的森林、林木和林地权属争议，争议各方依照国家和省有关规定签订过协议或者经过人民政府及其主管部门裁决的，按照原协议或者原裁决执行。1985年1月1日以后发生的森林、林木、林地权属争议，依照森林法律、法规的规定处理。

第三章　森林经营管理

第十条　各级人民政府应当依照《森林法》和《实施条例》的有关规定制定本行政区域的林业长远规划。县级以上人民政府林业行政主管部门应当依照林业长远规划制定林业发展计划。

国有林场、自然保护区、森林公园及其他国有森林经营单位应当根据林业长远规划和林业发展计划，编制森林经营方案，报上级人民政府林业行政主管部门批准后施行。

县级以上人民政府林业行政主管部门应当指导农村集体经济组织和国有农场、牧场、工矿企业等单位编制森林经营方案。

第十一条　省人民政府林业行政主管部门应当每五年组织一次全省森林资源清查。

县级以上人民政府林业行政主管部门应当分级建立健全森林资源档案，完善森林资源监测体系，掌握资源变化情况。

第十二条　县级以上人民政府林业行政主管部门应当按照规定征收育林费、森林植被恢复费。依法应当缴纳林业规费的单位或个人，应当按时缴纳林业规费。

县级以上人民政府林业行政主管部门应当严格依照规定的用途，使用林业规费。禁止任何单位和个人坐支、挪用。

第十三条　对森林、林木实行分类经营和管理。县级以上人民政府依照国家有关规定批准公布的防护林、特种用途林，作为生态公益林管理，只准进行抚育和更新性质的采伐。严禁采伐名胜古迹和革命纪念地的林木、自然保护区的森林。用材林、经济林、薪炭林作为商品林经营管理。

第十四条　用材林、经济林、薪炭林以及国务院规定允许转让的其他森林、林木的所有权或者经营权，可以依法转让，也可以作价入股或者作为合资、合作经营林木的出资、合作条件。

森林、林木所有权或者经营权依法转让，或者作价入股，或者作为出资、合作条件的，必须依法签订合同。对国有或者集体所有的森林、林木，应当由具备相应森林资源资产评估资格的单位进行评估。

依照本条第一款规定转让、作价入股或者作为出资、合作条件的，已经取得的林木采伐许可证可以同时转让。

第十五条　利用森林资源开展旅游等经营活动的，应当经省辖市人民政府林业行政主管部门批准。其中，利用森林和野生动物类型自然保护区开展旅游等经营活动的，应当报省人民政府林业行政主管部门批准。

第四章　森林保护

第十六条　县（市、区）、乡（镇）人民政府应当组织有关部门建立护林组织，负责护林工作。国有林场、自然保护区、森林公园和有林的农村集体经济组织及其他基层单位，应当建立健全护林组织，划定护林责任区，制定护林公约，配备护林员。护林员可以由县级或者乡级人民政府委任。护林员职责依照《森林法》的有关规定执行。

第十七条　依照国家有关规定设立的森林公安机关，负责维护辖区内的社会治安秩序，保护森林资源，并可以依照《森林法》的规定代行授权范围内的行政处罚权。

第十八条　根据国家规定划定的天然林保护区，实行退耕还林（草）、封山绿化、承包造林等措施，加强对天然林保护。具体保护管理办法由省人民政府制定。

第十九条　有森林防火任务的各级人民政府应当按照“预防为主、积极消灭”的方针，建立健全森林防火指挥机构，制定森林防火措施，做好森林防火的预防和扑救工作。

每年十一月一日起至次年四月三十日止，为我省森林防火期。有关县级人民政府可以根据当地自然条件和气候状况，决定提前或者延长本辖区森林防火期。

森林防火期内，禁止在林区野外用火。因特殊情况需要进行野外生产性、实验性用火的，须经县级人民政府林业行政主管部门或者乡（镇）人民政府批准，并采取相应的防火措施。

第二十条　发现森林火情的公民应当向当地人民政府、林业行政主管部门和森林防火组织报告。当地人民政府、林业行政主管部门和森林防火组织应立即组织扑救。

参加森林火灾扑救的单位和人员必须服从统一指挥。铁路、交通、民航、邮电等部门和单位应当为扑救森林火灾优先提供运输和通讯工具，粮食、物资、卫生、民政等部门和单位应做好物资供应、医疗保健和安置灾民工作。

第二十一条　县级以上人民政府林业行政主管部门负责组织森林病虫害防治工作，建立病虫害测报网络，加强森林病虫害的预测预报和林木种苗、木材的检疫工作，控制森林病虫害的传播和蔓延。

发生大面积暴发性或危险性森林病虫害时，当地人民政府应及时组织力量进行除治。

第二十二条　凡调运森林植物的种子、苗木、繁殖材料以及国家和省规定的其他应施检疫的森林植物、植物产品的，应当按照国务院《植物检疫条例》等有关法律、法规的规定检疫。不得重复进行检疫。

森林植物检疫人员持有效的执法证件进入车站、机场、邮局（所）、码头的货场、仓库及其他有关场所进行检疫检查，有关部门和单位应当予以配合。

第二十三条　对不同自然地带的典型森林生态地区、珍贵稀有野生动物和植物生长繁育地区，经省人民政府林业行政主管部门审核，报省人民政府批准，划定自然保护区，加强保护和管理。

严禁擅自进入森林和野生动物自然保护区采集标本、狩猎、采矿、采砂、垦植、放牧。

第二十四条　对具有特殊价值的植物资源，由县级以上人民政府林业行政主管部门建立档案，同级人民政府设立标志，明令保护。

第二十五条　禁止毁林开垦和毁林采石、采砂、采土、采种、采脂、砍柴及其他毁林行为。经批准的工程项目和地质勘探活动，应当不砍或者少砍林木。

禁止在幼林地、未成林造林地、特种用途林地内砍柴、放牧和非抚育性修枝。禁止在树旁焚烧秸杆、柴草及进行其他危害树木的行为。

第二十六条　以林木资源为原料生产食用菌的，县级以上人民政府林业行政主管部门应当将其林木消耗纳入当地森林采伐限额，不得突破。

第五章　植树造林

第二十七条　市、县（市、区）人民政府应当根据山区、丘陵区、平原区的实际情况，确定本行政区域内的森林覆盖率目标。全省森林覆盖率的目标，由省人民政府林业行政主管部门提出，报省人民政府批准实施。

第二十八条　植树造林必须遵守国家造林技术规程，因地制宜确定林种、树种，实行科学造林，积极推广优良树种、品种和造林新技术，提高造林质量。提高生态效益、社会效益和经济效益。

第二十九条　平原造林应当统一规划，并按照规划营造农田防护林、防风固沙林，实现农田林网化；主要河流的源头区、河渠两岸、水库堰坝周围、铁路和公路两侧，有关责任单位应当按照规划要求组织营造水源涵养林、水土保持林、护堤林、护岸林、护路林。

营造农田林网和进行农林间作应当符合造林设计密度。

第三十条　提倡实行封山育林。适宜进行封山育林的区域，由县级人民政府林业行政主管部门提出封山育林方案，报同级人民政府批准公布。

封山育林应当根据“以封为主，封育结合”的原则，确定适当的封育范围、年限及允许进入封育范围的期间等，并遵守封山育林技术规程。

在封山育林区域内，禁止放牧和采土、采砂、采石及其他采掘行为。但在当年的开山期内允许农民采药、采草。

第三十一条　鼓励单位和个人通过承包、拍卖、租赁等形式在宜林荒山荒地及村旁、水旁、路旁和村内隙地上按照当地人民政府的造林规划造林。采用承包、拍卖、租赁等形式造林的，应当签订书面合同，合同中应当载明双方的权利和义务，包括造林期限、数量和质量要求、利益分配以及违约责任等内容。

合同期满，原经营者依法享有同等条件下的优先经营权；因林木未成材或者其他原因不能采伐，原经营者又不再经营的，依法享有获取补偿的权利。

第三十二条　以政府投资为主的重点造林工程，应当实行招标投标制度。中标者应当严格按照设计方案组织施工。县级以上人民政府林业行政主管部门应当加强监督，并具体负责检查验收。

第六章　森林采伐

第三十三条　根据用材林的消耗量低于生长量的原则，严格控制森林年采伐量。国有林场管理的国有森林、林木以国有林场为单位，机关、团体、学校、部队和其他国有企事业单位，以及集体所有和农村居民自留山的森林、林木以县（市、区）为单位，铁路、公路、城建等部门组织营造并管理的森林、林木以省级系统主管部门为单位，编制森林年采伐限额，由省人民政府林业行政主管部门汇总平衡，经省人民政府审核，报国务院批准后施行。

年森林采伐限额，每五年调整一次。

第三十四条　采伐胸高直径五厘米以上（含五厘米）所消耗的立木蓄积，纳入采伐限额管理范围。但农村居民采伐自留地和宅基地上个人所有的零星树木以及自留山上的薪炭林除外。

第三十五条　采伐森林和林木，必须按照《森林法》和《实施条例》的有关规定，申请办理林木采伐许可证。严禁先采伐、后办证。法律、法规另有规定的除外。

第三十六条　因修建铁路、公路、机场、通讯设施、电力、水利工程和进行其他大型建设工程需要采伐林木的，由其建设单位向县级人民政府林业行政主管部门申请林木采伐许可证。跨越行政区域的，向其共同的上一级人民政府林业行政主管部门申请林木采伐许可证。

农村集体经济组织进行土地调整和乡村建设，应当严格控制采伐林木，确需采伐林木的，由该集体经济组织向县级人民政府林业行政主管部门申请林木采伐许可证。

因土地调整需要变更林木所有权的，实行树随地走、合理补偿的办法，由当事人协商解决；协商不成的，由村民委员会协调解决。但不得擅自砍伐林木。

第三十七条　由铁路、公路和城市园林等部门营造和管理的护路林和城镇林木，需要更新采伐的，应当分别由铁路、公路和城建等主管部门依照国家有关规定审核发放林木采伐许可证。

第三十八条　禁止采用皆伐方式采伐具有防护林性质的灌木林，确需进行抚育和更新性质采伐的，由林权所有单位制定水土保持方案，并向县级以上人民政府林业行政主管部门提出申请，经审核批准，发给林木采伐许可证后，方可采伐。

第三十九条　核发林木采伐许可证的部门和单位，对符合规定条件的，应当在接到采伐林木的申请之日起三十日内办理完毕。对不符合规定，不能办理林木采伐许可证的，应当向申请者说明理由。

第四十条　不按采伐限额管理规定及越权发放的林木采伐许可证无效。

禁止弄虚作假、以欺骗手段骗取林木采伐许可证。

使用无效采伐许可证采伐林木的，按无证采伐处理。

第四十一条　禁止采伐国家和省重点保护的珍贵树木，因科学研究等特殊情况，确需采伐的，按照国家植物保护法规的规定办理。

第七章　木材流通管理

第四十二条　木材交易应当到固定的交易市场内进行，但零星木材交易除外。木材交易市场由县级以上人民政府林业行政主管部门和工商行政管理部门依照各自职责进行管理。

天然林保护工程区内不得设立木材市场。

第四十三条　实行木材经营加工许可证制度。凡在太行山生态林区、黄河中上游天然林保护工程区、长江防护林区、淮河防护林区、平原农田防护林区从事木材经营加工的单位和个人，必须向县级人民政府林业行政主管部门申请领取木材经营加工许可证。

严禁无证从事木材经营加工活动。

第四十四条　严禁木材经营、加工单位和个人收购、销售无林木采伐许可证或者其他合法来源证明的木材。农村居民销售个人所有的木材，必须持有村民委员会开具的证明。

第四十五条　任何单位和个人从林区运输木材出县（市）境的，都必须持县级以上人民政府林业行政主管部门核发的木材运输证；国家统配的木材，由有关主管部门发给调拨通知书。铁路、交通及其他运输单位承运木材的，应当查验木材运输证件。

木材运输管理办法，按照省人民政府的规定执行。

第四十六条　经省人民政府批准设立的木材检查站，负责查验木材运输、森林植物检疫、野生动物及其产品等证件。

木材检查人员执行公务时，必须持执法证件，并佩戴标志。

第八章　法律责任

第四十七条　对违反本办法的行为，《森林法》、《实施条例》和有关法律、法规已有明确处罚规定的，按其规定执行。

第四十八条　骗取林木采伐许可证、木材运输证的，由县级以上人民政府林业行政主管部门没收骗取的证件和违法所得，并处二千元以上一万元以下的罚款；构成犯罪的，依法追究刑事责任。

第四十九条　未办理采伐许可证砍伐有争议林木的，按滥伐林木处理。

抢占有争议的林地的，按非法占用林地处理。

第五十条　破坏林木的，依法赔偿损失，由县级以上人民政府林业行政主管部门责令补种破坏株数一倍以上三倍以下的树木，并处以被破坏林木价值一倍以上五倍以下的罚款；违反《中华人民共和国治安管理处罚条例》的，由森林公安机关依法处理；构成犯罪的，依法追究刑事责任。

第五十一条　在树旁焚烧秸杆、柴草及其他行为对林木造成损害的，依法赔偿损失，由县级以上人民政府林业行政主管部门责令补种被损毁株数一倍以上三倍以下的树木，可以并处被损毁树木价值一倍以上五倍以下的罚款。

第五十二条　违反本办法规定，不按规定缴纳育林费、森林植被恢复费的，由县级以上人民政府林业行政主管部门责令其限期缴纳；逾期不缴纳的，按日加收千分之三的滞纳金，并可处以应缴费款的百分之十的罚款。

第五十三条　阻碍林业行政执法人员依法执行公务的，依照《中华人民共和国治安管理处罚条例》的规定处理；构成犯罪的，依法追究刑事责任。

第五十四条　违反本办法规定，有下列行为之一的，由上一级人民政府林业行政主管部门责令纠正，对直接负责的主管人员和其他直接责任人员依法给予行政处分；情节严重构成犯罪的，依法追究刑事责任：

（一）违反规定使用林业规费或坐支、挪用林业规费的；

（二）超越职权发放林木采伐许可证、木材运输证、木材经营加工许可证等证件的；

（三）不按规定核发林木采伐许可证的；

（四）林业行政执法人员从事执法活动未持证上岗、亮证执法的；

（五）林业行政执法人员滥用职权、玩忽职守、徇私舞弊的。

第九章　附　则

第五十五条　林地的保护管理，依照《河南省林地保护管理条例》的规定执行。

第五十六条　本办法自2001年5月1日起施行。